Processamento histológico
(Processamento do material, Da biópsia à lâmina histológica, Colorações histológicas, Colorações especiais, Técnicas complementares em dermatopatologia, Imuno histoquímica em dermatopatologia)
Da biópsia à lâmina
Pré-analítico
Da biópsia à lâmina
O processamento histológico compreende as etapas pelas quais o material passa desde a biópsia até se tornar uma lâmina histológica avaliável ao microscópio. Esse processo inclui a escolha adequada da lesão, a técnica de biópsia, a fixação, o transporte ao laboratório, a macroscopia, a clivagem, o processamento propriamente dito, a inclusão em parafina, o corte histológico e a coloração.
Escolha da lesão
A escolha da lesão é uma etapa fundamental para o diagnóstico histopatológico. As lesões mais adequadas costumam ser aquelas plenamente desenvolvidas ou próximas do pleno desenvolvimento. Lesões muito iniciais, muito evolutivas ou caducas podem não permitir um diagnóstico histopatológico específico.
Técnica de biópsia
A técnica cirúrgica deve ser adequada à hipótese diagnóstica. Em suspeita de paniculite, shave e punch geralmente não são técnicas ideais, pois podem não alcançar tecido celular subcutâneo suficiente. Em lesões exofíticas, polipoides ou císticas, o shaving pode ser uma técnica adequada. Em excisões tumorais maiores, a marcação da peça pelo cirurgião permite mapear margens e orientar a interpretação do comprometimento marginal.
Fixação em formol
O material deve ser corretamente fixado em solução de formol a dez por cento. Essa solução corresponde a uma parte da solução comercial de formol, em torno de trinta e oito a quarenta por cento, diluída em nove partes de água. Do ponto de vista químico, essa solução final é aproximadamente a quatro por cento.
Identificação do frasco
O frasco deve ser identificado no momento da biópsia. Identificações feitas previamente para todo o turno ou apenas ao final dos procedimentos aumentam o risco de troca de amostras entre pacientes. A conferência da identificação é responsabilidade do médico que realiza o procedimento, mesmo que a tarefa seja delegada a um auxiliar.
Requisição
A requisição deve conter dados mínimos para avaliação histopatológica: nome do paciente, idade, local da biópsia, tipo de lesão clínica, arranjo das lesões, distribuição em outros locais do corpo, tempo de evolução, resumo clínico, comorbidades e medicações relevantes. Essas informações ajudam a correlacionar os achados microscópicos com o quadro clínico.
Transporte
O transporte do material deve ser feito em recipiente adequado, evitando vazamento do fixador e perda da identificação externa. O frasco deve chegar ao laboratório preservando o material, o volume de fixador e as informações necessárias para rastreabilidade da amostra.
Macroscopia e clivagem
Macroscopia
Ao chegar ao laboratório, a peça é analisada macroscopicamente. A descrição inclui formato, medidas, cor, presença de lesão visível e relação da lesão com as margens. Essa etapa orienta a clivagem e define como os fragmentos serão representados nos blocos e nas lâminas.
Pintura das margens
A pintura das margens permite reconhecer margens reais e diferenciar um lado do fragmento do outro. Isso é importante porque as fatias podem ser incluídas em posições diferentes ou espelhadas. Sem a pintura, um comprometimento marginal pode ser interpretado de forma equivocada quanto à sua localização.
Clivagem
A clivagem define como a peça será seccionada e como as margens serão avaliadas. Na clivagem em pão de forma, a peça é fatiada em cortes seriados, geralmente com cerca de dois vírgula cinco a três milímetros de espessura, permitindo avaliar as margens laterais ao longo das fatias. Essa técnica fornece uma avaliação por amostragem considerada segura, embora não examine a totalidade das margens.
Avaliação das margens
Diferentes métodos de clivagem oferecem diferentes graus de avaliação marginal. A clivagem em cruz avalia menos margem do que a clivagem em pão de forma. Em peças grandes ou em situações selecionadas, podem ser feitas fatias tangenciais das margens, de modo semelhante ao raciocínio do slow Mohs, nas quais qualquer tumor presente no fragmento marginal indica comprometimento da margem.
Cassetes
Após a clivagem, os fragmentos são colocados em cassetes identificados. Cada cassete corresponde a uma parte específica da peça e dará origem a um bloco de parafina e, posteriormente, a uma lâmina. A identificação correta dos cassetes preserva a relação entre o achado microscópico e a região da peça examinada.
Processamento e corte
Processamento do tecido
O processamento histológico envolve passagem do material por concentrações crescentes de álcool, com objetivo de desidratar o tecido. Depois, o material passa pelo xilol, que remove o álcool e parte do conteúdo lipídico. Em seguida, o tecido é embebido em parafina derretida, que ocupa os espaços do fragmento e torna o material rígido, mas ainda maleável, permitindo a realização dos cortes histológicos.
Inclusão em parafina
Na inclusão, o fragmento processado é posicionado de modo que a superfície de corte fique orientada adequadamente no bloco de parafina. A parafina derretida é colocada em uma forma, geralmente usando o próprio cassete como suporte. Após resfriamento, forma se o bloco de parafina, que pode preservar o material por muitos anos.
Corte histológico
O bloco de parafina é colocado no micrótomo, que realiza cortes muito finos do tecido. Esses cortes são esticados em banho maria e pescados com lâmina de vidro. Antes da coloração, a lâmina ainda contém tecido praticamente incolor e não permite avaliação morfológica adequada ao microscópio.
Colorações
Rotina
Coloração de rotina
A coloração de rotina em dermatopatologia é a hematoxilina e eosina. Após a coloração, a lâmina recebe meio de montagem e lamínula, permitindo a avaliação microscópica. Apesar de existirem várias técnicas complementares, a hematoxilina e eosina continua sendo a base do diagnóstico histopatológico, pois a maioria das hipóteses diagnósticas deve ser estabelecida ou suspeitada pela morfologia.
Hematoxilina e eosina
A hematoxilina é um corante roxo e básico, com afinidade por estruturas ácidas, como os núcleos celulares. Estruturas coradas pela hematoxilina são chamadas basofílicas. A eosina é um corante ácido, com afinidade por citoplasma e fibras colágenas, produzindo tons de rosa, laranja ou vermelho. Estruturas coradas pela eosina são chamadas eosinofílicas. Quando uma estrutura se cora parcialmente pelos dois corantes, é chamada anfófila.
Histoquímica
Histoquímica é o uso de substâncias químicas para tingir tecidos de acordo com afinidades químicas. A hematoxilina e eosina é uma técnica histoquímica. As colorações especiais também são técnicas histoquímicas e permitem evidenciar estruturas pouco visíveis na rotina, inferir morfologia ou confirmar a natureza química de materiais como cálcio, mucina, fungos, fibras elásticas, hemossiderina ou amiloide.
Colorações especiais
PAS
O PAS, ou ácido periódico de Schiff, cora polissacarídeos, especialmente glicogênio, além de mucopolissacarídeos neutros. É útil para evidenciar membrana basal, glicogênio, diferenciação triquilemal, acantoma de células claras e parede celular de fungos. O glicogênio é PAS positivo e diástase sensível, enquanto membrana basal e fungos são PAS positivos e diástase resistentes.
PAS e membrana basal
A membrana basal não é visualizada adequadamente na hematoxilina e eosina, mas aparece no PAS como uma linha fúcsia delicada abaixo da camada basal. Essa propriedade pode ajudar na avaliação de bolhas subepidérmicas. Quando a membrana basal fica no assoalho da bolha, a clivagem está acima ou na região da lâmina lúcida. Quando fica no teto da bolha, a clivagem está abaixo da lâmina densa, como pode ocorrer em epidermólise bolhosa distrófica.
PAS e fungos
O PAS evidencia elementos fúngicos na camada córnea ou em tecidos profundos, permitindo melhor visualização de hifas, leveduras e suas características morfológicas. Na dermatofitose, por exemplo, hifas hialinas podem ser difíceis de perceber na hematoxilina e eosina, mas tornam se muito mais evidentes com PAS.
Grocott
A coloração de Grocott é uma técnica de impregnação pela prata utilizada para pesquisa de fungos. Os elementos fúngicos ficam pretos sobre fundo esverdeado. Ela facilita a identificação da morfologia fúngica, como variação de tamanho, gemulação e arranjos característicos, sendo útil em micoses profundas.
Fite Faraco
A coloração de Fite Faraco é utilizada para identificar bacilos álcool ácido resistentes. É particularmente sensível para o bacilo da hanseníase, que pode ser descorado por técnicas mais agressivas. Os bacilos se coram em vermelho e podem aparecer isolados ou agrupados em globias. A técnica também pode ser usada em tuberculose, micobacterioses atípicas e nocardiose.
Gram em tecido
A coloração de Brown Brenn é uma adaptação do método de Gram para cortes histológicos. Ela permite evidenciar bactérias Gram positivas em tonalidade azulada e Gram negativas em vermelho. Pode ser utilizada em piodermites, eritrasma, ceratólise plantar puntacta e vasculite séptica, quando se deseja visualizar bactérias comuns no tecido.
Tricrômicos
Os tricrômicos, como tricrômico de Gomori e tricrômico de Masson, coram epitélios e feixes musculares em vermelho e fibras colágenas ou filetes nervosos na cor de fundo, que pode ser verde ou azulada conforme a técnica. São úteis para visualizar estruturas musculares, neoplasias com diferenciação muscular e para diferenciar fascículos musculares de filetes nervosos.
Fontana Masson
A coloração de Fontana Masson é utilizada para evidenciar melanina, que se torna negra pela técnica de impregnação pela prata. É útil no estudo de desordens pigmentares, na avaliação de melanina epidérmica, melanófagos dérmicos e no diagnóstico de vitiligo em lesões desenvolvidas, caracterizadas por ausência de melanina e melanófagos.
Perls
O Perls, ou azul da Prússia, é utilizado para demonstrar hemossiderina. Em hematoxilina e eosina, melanina e hemossiderina podem ser difíceis de diferenciar, pois ambas podem aparecer como pigmentos acastanhados. No Perls, a hemossiderina fica azul turquesa, enquanto a melanina mantém a tonalidade marrom. Essa coloração é útil em púrpuras pigmentares, dermatite ocre, lipodermatoesclerose e lesões vasculares com suspeita de sarcoma de Kaposi.
Fibras elásticas
Verhoeff Van Gieson e orceína são colorações utilizadas para visualizar fibras elásticas, que não são bem identificadas na hematoxilina e eosina. Podem ser úteis no diagnóstico de anetodermia, cicatrizes antigas, pseudoxantoma elástico e outras doenças que envolvem redução, destruição ou alteração das fibras elásticas.
Mucina
Ferro coloidal e azul de Alcian em pH dois vírgula cinco são técnicas utilizadas para demonstrar mucopolissacarídeos ácidos, como ácido hialurônico e mucina. A mucina pode aparecer na hematoxilina e eosina como áreas pálidas ou discretamente basofílicas, mas se torna azulada nessas colorações. Elas são úteis em doenças com aumento de mucina, como granuloma anular, lúpus eritematoso, dermatomiosite e mucinoses.
Criptococo e mucina
O criptococo possui cápsula gelatinosa rica em mucina. Por isso, além de se corar por técnicas para fungos como PAS e Grocott, pode ser evidenciado por colorações para mucina, como ferro coloidal, azul de Alcian e mucicarmina. Essa positividade da cápsula contribui para a especificidade diagnóstica da criptococose.
Von Kossa
Von Kossa é uma coloração utilizada para cálcio, que passa a assumir cor preta. O cálcio muitas vezes já é reconhecível na hematoxilina e eosina como material amorfo intensamente basofílico, mas a técnica pode confirmar sua natureza. Pode ser utilizada em calcinoses e no pseudoxantoma elástico, em que fibras elásticas degeneradas apresentam depósito de cálcio.
Giemsa
Giemsa contém azul de metileno, um corante metacromático. É utilizado principalmente para evidenciar grânulos citoplasmáticos de mastócitos, que se coram em violeta. Também pode ser usado para identificar formas amastigotas de Leishmania, embora a hematoxilina e eosina possa ser suficiente em muitos casos.
Vermelho do Congo
Vermelho do Congo é uma coloração utilizada para material amiloide. O material se cora em vermelho e, sob microscopia de polarização, apresenta birrefringência verde alaranjada. Essa técnica pode ser usada na avaliação de depósitos amiloides cutâneos, embora funcione melhor em material fresco submetido a cortes de congelação.
Imuno-histoquímica
Imuno-histoquímica
Imuno histoquímica
A imuno histoquímica é um método de identificação de antígenos específicos por anticorpos conjugados a enzimas que reagem com cromóforos e geram uma cor visível no corte histológico. Diferente da histoquímica, que se baseia em afinidades tintoriais mais gerais, a imuno histoquímica identifica antígenos de modo mais específico.
Métodos de imuno histoquímica
Entre os métodos de imuno histoquímica estão o método direto, o indireto, o método avidina biotina e o método do polímero. O método do polímero aumenta a sensibilidade e evita o problema de reação com biotina endógena. A cor da reação depende da enzima e do substrato utilizados, e não do anticorpo primário. O sistema peroxidase DAB costuma gerar positividade marrom, enquanto a fosfatase alcalina fast red gera positividade vermelha.
Aplicações
A principal aplicação da imuno histoquímica é determinar a linhagem celular quando a morfologia não é suficiente. Também pode identificar antígenos virais, microorganismos, marcadores com implicação prognóstica e alvos terapêuticos. Ela tem valor limitado para distinguir benignidade de malignidade quando usada isoladamente.
Limites do método
A imuno histoquímica é uma técnica valiosa, mas deve ser entendida como subsidiária da morfologia, não como substituta. O estudo pela hematoxilina e eosina continua sendo a base do diagnóstico. As técnicas complementares são mais úteis quando respondem a uma pergunta específica ou confirmam uma hipótese formulada a partir da avaliação morfológica.